Fauveliopsidae Hartman, 1971 es una pequeña familia de Anélidos marinos que se encuentra habitualmente en fondos de cierta profundidad (hasta 6.000 m), si bien algunas especies han sido localizadas en ambientes mucho más someros, por encima de los 100 m (Katzmann & Laubier, 1974; Riser, 1987; Núñez et al., 1997; López, 2011; López & Martínez, 2018). Su tamaño corporal oscila entre 1,3 y 20 mm de longitud y su número de segmentos es habitualmente menor de 30 (Rouse, 2001a). La familia comprende cerca de 20 especies bentónicas y detritívoras (Thiel et al., 2011; Zhadan & Atroshchenko, 2012; Zhadan & Salazar-Vallejo, 2014), repartidas en dos géneros: Fauveliopsis McIntosh, 1922 y Laubieriopsis Petersen, 2000 (López & Martínez, 2018).

La especie objeto de este estudio, Laubieriopsis cabiochi (Amoureux, 1982), muestra una organización corporal típica del género, con un cuerpo alargado, una región anterior ligeramente dilatada, que comprende el prostomio, peristomio y los tres primeros segmentos setígeros, y una región posterior de anchura uniforme, de sección cilíndrica, provista de 18 setígeros y que termina en un pigidio sencillo. La especie había sido descrita originalmente en aguas del Atlántico Norte dentro del género Fauveliopsis y fue posteriormente transferida al género Laubieriopsis por Petersen (2000). Además de su area typica, L. cabiochi ha sido citada en volcanes de fango del Golfo de Cádiz por Cunha et al. (2013) así como en el Océano Pacífico por Magalhaes et al. (2014). Descripciones recientes pueden encontrarse en Petersen (2000) y Magalhaes et al. (2014).

Los ejemplares examinados fueron recogidos durante las campañas BIOICE (Benthic Invertebrates of Icelandic Waters), las cuales han sido parte de un programa internacional para estudiar la fauna bentónica marina correspondiente al área económica exclusiva de Islandia (Meiβner et al., 2014). El área de muestreo de estas campañas cubrió un rango de profundidad comprendido entre 200 y 3.500 m a ambos lados de la cresta submarina (GIF Ridge) existente entre Groenlandia, Islandia y las Islas Feroe; en dicha cresta, el fondo marino se eleva hasta los 500 m de profundidad en su cúspide, marcando así una clara barrera geográfica entre las aguas frías del Océano Ártico al norte y las aguas más templadas del Atlántico Norte al sur (Thiel et al., 2011).

El examen de los ejemplares se ha realizado principalmente a través de microtomografía computarizada (micro-CT o μCT), la cual se basa en la creación de imágenes de rayos X mediante el mismo método utilizado en exploraciones de tomografía computarizada hospitalaria, aunque en este caso a pequeña escala y con una resolución muy superior (Bruker micro-CT, 2016). Los materiales densos que componen las muestras se pueden observar con esta técnica sin necesidad de preparaciones adicionales; sin embargo, con objeto de mejorar el contraste, en ocasiones los tejidos blandos requieren un tratamiento adicional con tinciones de alto peso molecular (Golding & Jones, 2007). En los últimos años, su empleo en estudios anatómicos en el ámbito de la zoología se está incrementando sensiblemente, particularmente en Moluscos y Artrópodos, si bien existen antecedentes también con Anélidos. Así, Dinley et al. (2010), Faulwetter et al. (2013a, 2013b, 2014) y Paterson et al. (2014) emplearon este método demostrando que las imágenes obtenidas pueden aportar detalles anatómicos muy relevantes. Recientemente, Parapar & Hutchings (2014) y Parapar et al. (2015a, 2015b, 2016, 2018a, 2019) han empleado el μCT en el estudio morfo-anatómico de varias especies de Anélidos (correspondientes a la antigua clase Polychaeta, ahora sin validez sistemática dada su naturaleza parafilética), continuando la exploración de sus posibilidades frente a otras técnicas anatómicas clásicas como la microscopía óptica y electrónica de barrido y las secciones histológicas.

El objetivo de este trabajo se centra en el estudio de la anatomía externa e interna de L. cabiochi utilizando por primera vez en esta familia la técnica de μCT, evaluando su efectividad frente a los estudios histológicos clásicos publicados sobre especies próximas (Zhadan & Atroshchenko, 2010; Purschke, 2011; Thiel et al., 2011), así como otros estudios recientes con otras especies de Anélidos poliquetos.

Se han empleado seis ejemplares de Laubieriopsis cabiochi recogidos durante las citadas campañas BIOICE frente a la costa noroeste de Islandia. Información detallada de las características abióticas de cada una de las estaciones y muestras recogidas en las distintas campañas de este proyecto puede encontrarse en el siguiente enlace: http://utgafa.ni.is/greinar/BIOICE_station_list_91-04_Paper_A2.pdf. Una descripción de la especie a partir de ejemplares de la zona puede encontrarse asimismo en Petersen (2000). Los ejemplares provienen de la muestra 2717, estación 734, campaña B-13-94, recogida el 07/09/1994 mediante un trineo epibentónico Rothlisberg-Pearcy (“RP”) a 256 m de profundidad y con una temperatura de fondo de 5,6°C frente a la península de Snaefellsness (64°30’30’’ N; 25°43’60’’ W). El proceso de triado de muestras, fijación inicial de los ejemplares en formol 4% y posterior inclusión en alcohol 70° para su conservación definitiva, se realizó en el Southwest Iceland Nature Research Centre, antes Sandgerdi Marine Centre (Reykjanes, Islandia). Inicialmente, tres ejemplares destinados al examen con μCT se sometieron a un mismo proceso de deshidratación a través de diferentes baños consecutivos de etanol a 80°, 90° y 96°, y metanol absoluto durante 24 horas cada uno. A continuación, cada ejemplar se trató de manera diferente. El primero (8,18 mm de longitud) no se sometió a ningún proceso de tinción, el segundo (6,46 mm) se tiñó con Iodina (IOD) al 1% en metanol durante una semana y el tercero (8,58 mm) se tiñó en Ácido Fosfotúngstico (PTA) al 1% en metanol durante tres días. Por último, los tres ejemplares se sometieron a un proceso de deshidratación con Hexametildisilazano (HMDS) durante 24 horas, dejándose secar posteriormente durante toda la noche con el objeto de eliminar el agua de los tejidos y aumentar la claridad y el contraste de las imágenes obtenidas tras el escaneo de la muestra en el μCT (Paterson et al., 2014). Las muestras se montaron en micropipetas siguiendo el método Bruker (Bruker microCT, 2016) y posteriormente se escanearon utilizando un microtomógrafo SkyScan 1172, a un voltaje de 55 kV, con una corriente de 165 μA, sin filtro, un tamaño de píxel de 1,5 μm y con una rotación de 180°. Las proyecciones de rayos X (radiografías) del escaneo se reconstruyeron con el Software NRecon, y posteriormente, las secciones transversales obtenidas fueron procesadas mediante los programas CTAn y DataViewer, que nos permitieron obtener cortes frontales y sagitales. Las representaciones en 3D fueron obtenidas con el programa CTVox.

Los tres ejemplares mencionados se encuentran depositados en el Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid con los números de registro 16.01/18540 (ejemplar no teñido), 16.01/18441 (ejemplar teñido con Iodina) y 16.01/18542 (ejemplar teñido con PTA). De modo complementario, otros tres ejemplares procedentes de la misma muestra, pero no tratados para μCT, fueron asimismo depositados en el mismo museo con el número de registro 16.01/18543. Los “dataset” se encuentran a disposición de cualquier investigador que lo solicite poniéndose en contacto con el primer autor.

Abreviaturas empleadas en el texto y figuras

A continuación, se presentan los resultados obtenidos tras el estudio de los seis ejemplares de Laubieriopsis cabiochi arriba citados, comparando el ejemplar no teñido con los que siguieron un proceso previo de tinción.

El examen de poliquetos por medio de microtomografía computarizada (μCT) (p. ej. Parapar et al., 2015a, 2015b, 2016, 2018a, 2018b, 2019) ha revelado que las imágenes tanto de su anatomía externa como interna son un buen complemento de aquellas obtenidas mediante el estudio histológico tradicional. Este hecho resulta particularmente relevante para estudios de reconstrucción anatómica, la cual, tanto en poliquetos como en Clitelados (p. ej. Fernández et al., 2014; Fend et al., 2017) y Moluscos Solenogastros (p. ej. Pedrouzo et al., 2014), ha sido tradicionalmente abordada a partir de cortes histológicos seriados, que implican una alteración de la integridad de los ejemplares. Por ello, una de las mayores ventajas de las disecciones virtuales obtenidas con μCT es la de permitir el estudio de los distintos órganos internos sin destruir el ejemplar, ofreciendo además la posibilidad de observar su posición espacial natural, la cual puede verse sensiblemente alterada durante la realización de los cortes histológicos.

Riser (1987), Zhadan & Atroshchenko (2010, 2012) y Zhadan & Salazar-Vallejo (2014) estudiaron la anatomía interna de Laubieriopsis arenicola (Riser, 1987) y Laubieriopsis norvegica Zhadan & Atroshchenko, 2012 respectivamente; la segunda especie es muy próxima tanto taxonómica como geográficamente a los ejemplares de L. cabiochi estudiados aquí, si bien su examen se realizó empleando técnicas histológicas. Los resultados obtenidos en estos trabajos muestran en términos generales los mismos elementos corporales descritos en nuestro estudio, y cuya diferencia fundamental, particularmente en los trabajos de Zhadan y colaboradores, radica en la obtención de imágenes de mucha mayor resolución, a nivel tisular y celular.

En el caso de la anatomía externa, a diferencia de otros poliquetos, pocos son los elementos anatómicos destacables en Laubieriopsis. Sin embargo, las denominadas “papilas epidérmicas” localizadas bajo las papilas interramales de los parápodos citadas por Zhadan & Atroshchenko (2010) para Laubieriopsis norvegica, no han sido identificadas en nuestros ejemplares. Por el contrario, estos elementos sí han sido detectados en otros individuos estudiados al Microscopio Electrónico de Barrido (MEB, resultados no incluidos en este estudio) lo cual revela ciertas limitaciones del μCT en el estudio de la anatomía externa. Asimismo, es destacable la baja definición de las imágenes obtenidas de las sedas, de calidad muy inferior a las logradas con el MEB o la microscopía óptica, lo cual corrobora lo visto en otros casos con otras especies de poliquetos (p.ej. Parapar et al., 2017, 2018a, 2018b, 2019).

En cuanto a la anatomía interna, hemos encontrado ciertos aspectos no descritos en los trabajos mencionados anteriormente. En primer lugar, la distinción entre la región “esofágica” e “intestinal” (sensu Riser, 1987 y Zhadan & Atroshchenko, 2010) es evidente, pero, por el contrario, no se ha distinguido claramente la presencia de la faringe, ya sea en los cortes longitudinales o transversales, ni la diferente naturaleza de su pared dorsal y ventral mencionada por Zhadan & Atroshchenko (2010; fig. 3A). Los dos componentes más voluminosos del sistema muscular (capa longitudinal parietal dorsal y ventral y músculos retractores del prostomio) que describieron estos autores son claramente patentes en las imágenes de μCT, pero también lo son los gruesos músculos asociados al movimiento de las sedas parapodiales, no mencionados por ellos. Finalmente, se confirma también la presencia de un vaso sanguíneo longitudinal ventral al tubo digestivo, así como de otro dispuesto dorsalmente respecto a éste. Ambos habían sido previamente referidos por Zhadan y colaboradores, si bien éstos reconocen que este último es de menor diámetro. Finalmente, se ha observado un posible plexo sanguíneo en íntima relación con el intestino a la altura, al menos, de los setígeros 8-9, una característica que es común en poliquetos (Rouse & Pleijel, 2001) pero no mencionada por Zhadan & Atroshchenko (2010).

La técnica de μCT no necesita un tratamiento complejo de las muestras, en todo caso mucho más sencillo que la realización de cortes histológicos. Sin embargo, presenta ciertas limitaciones en cuanto a la calidad de las imágenes resultantes. Esto es debido a que el escaneo y reconstrucción posterior de las imágenes se basa en la densidad a los rayos X de los distintos elementos corporales, por lo que aquellos órganos con densidades similares son difíciles de discriminar entre sí. Asimismo no aporta información en cuando a la naturaleza celular de sus componentes siendo esto una de sus principales desventajas en relación con las imágenes obtenidas a partir de técnicas histológicas. Este hecho es evidente con respecto a la pared corporal y sobre todo al sistema nervioso. Así, las imágenes de μCT tanto en 2D como en 3D muestran una pared del cuerpo y de los órganos internos muy simplificada respecto a las obtenidas mediante histología (Zhadan & Atroshchenko, 2010). En el caso de la pared corporal, la capa cuticular y epidermis subyacente se corresponderían con una simple línea blanca, diferenciándose únicamente de la musculatura longitudinal subyacente por su menor densidad a los rayos X, y bajo la cual la capa celular peritoneal tampoco es distinguible. La cadena nerviosa ventral aparece poco o nada ganglionada (Zhadan & Atroshchenko, 2010), y se distingue claramente frente a la musculatura longitudinal ventral que la flanquea; sin embargo, la morfología, anatomía y posición espacial del cerebro solo se ha podido inferir a partir de su posición intraprostomial ya referida por otros autores (Zhadan & Atroshchenko, 2010; Purschke, 2011). Los lóbulos cerebrales posteriores, tanto los latero-ventrales descritos por Zhadan y Atroshchenko (2010) como los medio-dorsales observados por Thiel et al., (2011) en Laubieriopsis confusa Thiel, Purschke & Böggemann, 2011, no se pueden diferenciar claramente de los músculos retractores prostomiales entre los cuales se localizan, a pesar de su supuesta diferente densidad (Figs. 4A, C). En el mismo sentido, las imágenes microtomográficas no muestran con detalle la naturaleza histológica fina del cerebro; por ejemplo, el neuropilo, muy evidente en las imágenes de Thiel et al. (2011), no ha podido ser detectado.

En relación con estos dos elementos anatómicos, las secciones transversales obtenidas con μCT han revelado, sin embargo, la presencia de un elemento corporal muy bien definido y curiosamente no registrado anteriormente para esta familia. Se trata de unas fibras muy evidentes dispuestas entre la línea medio-ventral corporal (aparentemente asociadas a una cadena nerviosa) y la pared corporal lateral. Estos elementos (Fig. 5) podrían corresponder a ramas nerviosas segmentarias o bien, dado su diámetro y densidad, a paquetes de musculatura oblicua; dicha musculatura no ha sido reportada por Zhadan & Atroshchenko (2010) para L. norvegica, si bien su presencia es muy común entre los poliquetos (Rouse, 2001b; Rouse & Pleijel, 2001), como es el caso de Cossura pygodactylata Jones, 1956 (Zhadan et al., 2014; Parapar et al., 2018a).

Las imágenes 2D se han revelado complementarias a las 3D, pues si bien con las primeras se pierde la información volumétrica de la muestra -sí aportada por las segundas- se gana en la definición de los límites de los distintos elementos anatómicos, particularmente de aquellos más delicados o de menor tamaño, y que por tanto podrían llegar a pasar desapercibidos entre el gran volumen de información aportada por las imágenes 3D. Este es el caso de los septos y mesenterios y su relación con la región esofágica del digestivo, cuya presencia en las imágenes 2D es mucho más evidente que en las 3D (Figs. 3B y 4B vs. 7C y 7B).

El análisis comparativo de los resultados obtenidos con los ejemplares teñidos con Iodina y PTA frente al no teñido muestra, en coherencia con resultados de trabajos anteriores como Metscher (2009a) con Vertebrados y otros grupos de Invertebrados, afinidades diferentes por los distintos tejidos en los primeros. Así, mientras que la tinción con Iodina se asocia tanto a los tejidos blandos como a las estructuras calcificadas y polisacáridos, destacando en este caso derivados epidérmicos como la cutícula, mandíbulas y ciertos tipos de sedas, el PTA lo hace a proteínas como la fibrina y el colágeno, destacado más el tejido epidérmico que la anterior, así como las fibras musculares (Faulwetter et al., 2013a, 2013b). En nuestro estudio, el ejemplar que mostró una reconstrucción posterior con imágenes más detalladas en términos generales fue el no teñido, mientras que el teñido con Iodina mostró resultados de inferior calidad. Sin embargo, el tratado con PTA aportó imágenes muy comparables a las del ejemplar no teñido, superándolo en términos de nitidez de la superficie corporal (Fig. 2A vs. 2B-C) así como también en ciertos casos de estructuras internas sobre todo de naturaleza muscular, como la musculatura oblicua y la retractora prostomial, tan característica de esta familia; todo ello corrobora las observaciones de los autores citados anteriormente. Por su parte, las imágenes tanto del tejido nervioso como del circulatorio, salvo en el caso de la cadena nerviosa ventral y el vaso sanguíneo subentérico respectivamente, no han mostrado, por el contrario, el mismo grado de nitidez.

La presencia potencial de un plexo circulatorio asociado al intestino observado en el individuo sin teñir podría ser un aspecto novedoso en el conocimiento anatómico de los fauveliópsidos. Sin embargo, la falta de réplicas no permite confirmar su existencia de forma definitiva, pues la posibilidad de artefactos en las imágenes es un hecho constatado en estudios recientes con otras especies de poliquetos mediante esta técnica (Parapar et al., 2018a, 2018b, 2019). En este sentido, hemos detectado un nuevo ejemplo de artefacto en relación con los estrechamientos del esófago. Como puede observarse en la figura 4A, en imágenes coronales de la zona ventral del cuerpo, aparecen estructuras asociadas a estas zonas, entre los setígeros 4-5 y 5-6, que podrían, particularmente en el segundo caso, asociarse a un ganglio de la cadena nerviosa ventral. Se descarta que puedan ser elementos nerviosos pues tanto aquí como en estudios anteriores se reconoce que la cadena nerviosa ventral en Laubieriopsis está mínimamente ganglionada, por lo que esta imagen muy posiblemente se trate realmente del encuentro del revestimiento interno a ambos lados del esófago a este nivel, como se muestra en el corte transversal al mismo nivel en la figura 5D.

El principal problema de los organismos que presentan un cuerpo blando, como es el caso de los Anélidos, radica en que la absorción de los rayos X es comparativamente mucho menor que la de aquellos que muestran elementos duros como la concha de Moluscos (Marcondes Machado et al., 2019), espículas de Poríferos (Heim & Nickel, 2010), estatolitos de Cnidarios Escifozoos (Holst et al., 2016) o el exoesqueleto de Artrópodos (Sombke et al., 2015); por lo tanto, las imágenes resultantes tienen una resolución diferencial comparativamente mucho menor. Las estructuras duras que presentan algunos poliquetos como paragnatos en la probóscide de Nereididae, papilas faríngeas de Phyllodocidae, opérculos de Serpulidae o sedas de gran tamaño (p. ej. paleas de Ampharete), pueden ser visualizadas perfectamente (ver Parapar et al., 2017, 2018a, 2018b), pero en la mayoría de los caracteres internos (p. ej. sistema muscular, digestivo y nervioso) puede resultar difícil discriminar la naturaleza de cada uno de sus componentes. En este sentido, es muy importante tener en cuenta el tipo de tinción a emplear; de hecho, la mayoría de las tinciones que se utilizan en microtomografía no son específicas, a diferencia de las empleadas en histología, de las que muchas han sido diseñadas específicamente para destacar tejidos o células particulares. La mayoría de las tinciones utilizadas para μCT se emplean para simplemente mejorar el contraste, pero no para discriminar entre distintos tejidos (Golding & Jones, 2007) aunque en algunos trabajos posteriores ya hay avances significativos en este sentido, si bien no en Anélidos (Metscher, 2009a, 2009b). Otro problema añadido radica en que estas tinciones tienen que ser capaces de penetrar lo más profundamente posible en la muestra, y ser de un peso molecular suficiente como para absorber eficazmente los rayos X, lo cual se ve obstaculizado por la baja permeabilidad, frente al material fresco, de las muestras previamente deshidratadas en alcohol (Paterson et al., 2014).