Los especímenes examinados en este estudio procedían de la colección mastológica del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia. Las muestras incluyeron en total 47 cráneos Sylvilagus (31 S. brasiliensis, 16 ♂♂, 13 ♀♀ y 2 de sexo no registrado) y 16 S. floridanus (6 ♂♂, 7 ♀♀ y 3 de sexo no registrado). La clasificación de los 47 especímenes se basó según la identificación a nivel de especie en el catálogo, que no contenía información sobre la edad. La información individual de los especímenes estudiados puede requerirse al autor. Con el objetivo de minimizar el error en las escalas, todos los cráneos fueron fotografiados siempre por el propio autor, estableciéndose un protocolo estándar para la toma de las imágenes (uso de una escala en cada foto, calibración de luz proveniente de la cámara, abertura y velocidad de disparo controlados) (Parés-Casanova, 2013; Samuel et al., 2015).

Se obtuvieron imágenes digitales, en el plano dorsal de cada cráneo, mediante una cámara digital Nikon D1500 equipada con una lente 40 mm 1:2.8G MicroNikkor. Cada espécimen se colocaba previamente en el centro del campo óptico, con su cara dorsal orientada paralelamente a la cámara. A fin de eliminar distorsiones de las posiciones relativas de los ángulos debido a un efecto parallax –de profundidad- (Webster & Sheets, 2010), la cámara se situó a suficiente distancia para asegurar que el cráneo ocupara únicamente una parte del campo visual, libre de distorsiones. El no tener en cuenta el criterio de coplanaridad podría provocar una interpretación errónea de resultados, dado que pueden existir variaciones importantes de la forma no apreciables en el plano paralelo a la toma fotográfica (Toro Ibacache et al., 2010). Se incluyó en cada toma un patrón milimétrico a fin de establecer la longitud cefálica real.

Las imágenes fueron almacenadas en extensión .jpg de 9.3 Mb de promedio y posteriormente se transfirieron al computador. Se situaron 12 hitos anatómicos en cada espécimen (Fig. 1), basados parcialmente en estudios previos (Ge et al., 2015; Parés-Casanova et al., 2018), y definidos como:

Todos los puntos craneométricos considerados corresponden a puntos definidos a partir de referentes anatómicos homólogos y repetibles, se consideraron suficientes para reflejar la morfología en su cara dorsal del neurocráneo y del viscerocráneo, y fueron situados en cada espécimen mediante el programa TpsDig versión 1.40 (Rohlf, 2010).

Los hitos seleccionados generaron una matriz de coordenadas (X e Y) que representan las configuraciones geométricas del cráneo por espécimen. La matriz de configuraciones de coordenadas fue sometida a un Análisis Generalizado de Procrustes, donde la variación asociada a los efectos de posición, orientación y escala fue eliminada mediante una superposición Procrustes, usando la estimación de los mínimos cuadrados (Bookstein, 1992; Adams, 1999). En líneas generales este análisis consta de tres pasos iterativos: 1) cada configuración se centra en el origen del sistema de coordenadas y luego se ajusta a una unidad de tamaño común; 2) las configuraciones escaladas se trasladan unas sobre otras sobreponiéndose, de tal modo que coincidan sus centros de gravedad (centroides); y 3) se rotan hasta minimizar las distancias entre cada hito y una configuración promedio, utilizando el criterio matemático de los mínimos cuadrados (Zelditch et al., 2004; Savriama et al., 2010; Toro Ibacache et al., 2010).

La correlación de la forma de los especímenes con el espacio tangente -en el que las configuraciones son proyectadas de manera ortogonal- (Toro Ibacache et al., 2010) se analizó con el programa TpsSmall versión 1.33 (Rohlf, 2010).

A partir del patrón utilizado en cada fotografía se obtuvo la longitud craneal, expresada en mm, del cráneo, entendida como la distancia de los hitos 1 a 2. La comparación de las longitudes entre ambas especies se realizó con un test U de Mann Whitney. Se obtuvo así mismo el valor F el test de Goodall a fin de evaluar la distancia entre ambos grupos (Bookstein, 1992).

A fin de evitar distorsiones producidas por una posible asimetría bilateral, y aunque no se detectó asimetría fluctuante entre el hemicráneo derecho e izquierdo (analizada mediante un ANOVA de dos vías, en la que se consideró la interacción “individuo*lado” como asimetría fluctuante (Klingenberg, 2015) y que reflejó un valor p = 0,860), se trabajó con el promedio de las coordenadas Procrustes de los lados izquierdo y derecho reflejados especularmente.

Las diferencias en la forma fueron analizadas con un test NPMANOVA (“Non Parametric Multivariate ANalysis Of VAriance”), utilizando el de dos vías para detectar posibles diferencias entre sexos (los 5 especímenes no sexados fueron excluidos) y entre especies, recurriendo al uso de la distancia euclideana entre coordenadas Procrustes y aplicando 9.999 permutaciones y un test F de Goodall posterior (Bookstein, 1992). La alometría se interpretó como en cambio de la forma en relación al tamaño (o sea, como la regresión de las coordenadas Procrustes versus el tamaño del centroide, logarítmicamente transformado) (Mosimann, 1970; Savriama et al., 2010; Klingenberg, 2016).

Se realizó finalmente un Análisis de Componentes Principales (ACP) a partir de la matriz de varianza-covarianza (Bookstein, 1992), a fin de detectar las variables anatómicas que explicaban más las diferencias entre especies. Se utilizaron además mallas de deformación (Zelditch et al., 2004) para analizar los cambios de forma, en los ejemplares más extremos. A fin de eliminar el efecto alométrico se procedió finalmente a un segundo NPMANOVA utilizando los valores de cada espécimen en cada uno de los componentes principales (Savriama et al., 2010).

La obtención de las coordenadas Procrustes y tamaño de centroide se realizó con el programa MorphoJ (Klingenberg, 2011). Con la herramienta TpsRelWarp versión 1.63 (Rohlf, 2010) se obtuvieron las variables del cambio uniforme en X e Y. El resto de análisis se efectuó con el programa PAST versión 2.17c (Hammer et al., 2001). El nivel de significación se estableció en el 5%.

El valor de la correlación (0,999) indicó que las inferencias sobre la forma de éstas especies estudiadas pueden ser analizadas en el espacio lineal tangente, lo que nos permitió el uso de la aproximación del plano en los análisis estadísticos siguientes.

El análisis NPMANOVA (del que se excluyeron los especímenes sin sexo registrado) reflejó la ausencia de diferencias entre sexos (p = 0,504) pero la presencia de diferencias estadísticamente significativas entre especies (p = 0,009) (Tabla 1). Para los análisis posteriores, pues, se agruparon los cráneos sin diferenciar por sexo. El test F de Goodall presentó un valor sin diferencias significativas (F_20,900 = 0,939; p = 0,536), de lo que se deduce que las distancias Procrustes entre la forma de referencia y la forma objetivo presentaban valores bajos. El test de Mann Whitney demostró una diferencia estadísticamente significativa para la longitud craneal entre ambas especies (U = 60, p << 0,0001) (Fig. 2). Para ambas especies, la alometría era significativa (p < 0,001) (Fig. 3).

Los dos primeros componentes principales explicaron un 68,57% de la varianza total observada (PC1 + PC2 = 52,36 + 16,21 %) (Tabla 2), apareciendo los hitos faciales (X1, X2, X3) y los de la bóveda craneal (X e Y11, X e Y12) como los más discriminantes (Fig. 4). O sea, que tanto los hitos situados en el esplacnocráneo como en el neurocráneo contribuyeron a la diferenciación entre especies. Se aprecia que la trayectoria del cambio de cada vector a nivel de la cara se dirige longitudinalmente, es decir, rostral o caudal, y por otra parte, los puntos neurocraneales de ambos lados tienden principalmente de manera transversal, es decir, la mayor variación captada se localiza en el tercio distal de la cara y en la porción lateral de la calvaria (Fig. 5), lo que se atribuye mayoritariamente a diferencias en longitud facial (mayor en S. floridanus) y anchura neurocraneal (mayor en S. brasiliensis) (Fig. 6). O sea, que la tendencia con el aumento de tamaño es hacia una expansión facial y una contracción de la calvaria (Fig. 7).

En el nuevo NPMANOVA utilizando los valores de cada espécimen en cada uno de los componentes principales, siguen manifestándose diferencias entre especies (p = 0,0078) pero no entre sexos (p = 0,599).